Bonjour,
Je recherche des conseils pour la culture primaire de fibroblastes de souris. Je suis en doctorat de biologie, mon objectif est de réaliser une expansion cellulaire de fibroblastes gingivaux de souris. Je souhaite obtenir un maximum de cellules en un minimum de passage.
Voici mon mode opératoire actuel :
- J0 : Prélèvement de gencive de souris (je prélève le maximum de tissu au niveau de la cavité bucale, y compris le palais), découpe des tissus en petits fragments que je laisse adhérer au fond d'une flasque une heure avant d'ajouter délicatement du DMEM 20% FCS + 1% peni/strep et 1% fungizone
- Le milieu est changé deux fois par semaine
- J+14 : Premier passage des Fibroblastes (lavage PBS, trypsine, neutralisation, centrifugation, comptage/viabilité), je les repique à 10^6 pour une flasque de 150 cm2 dans du DMEM 10% + 1% peni/strepto et 0,5% fungizone.
- Le milieu est changé deux fois par semaine
- J+28 : 2e passage est j'utilise mes cellules pour une thérapie cellulaire sur souris.
Voici mon problème, je garde toujours un peu de cellules pour les remettre en culture mais à partir de là, elles changent de morphologie et sont plus grosses, pas mal d'entre elles meurent et beaucoup de débris sont présent dans le surnageant de culture. Je suppose que ce sont les signes de sénescence de la culture primaire.
J'ai déjà essayé de faire un 2e passage à J+21 et faire ma thérapie au passage 3 mais les cellules montrent "précocement" les signes de sénescence entre P2 et P3, c'est la raison pour laquelle je laisse mes cellules en culture deux semaines jusqu'à une très forte confluence. Je sais que garder des cellules à confluence n'est pas très conseillé mais c'est la seule alternative que j'ai trouvé.
Y aurait il quelqu'un qui aurait des conseil à me donner sur la culture primaire de souris?
J'essai aussi de mettre en culture des cellules musculaires lisses de souris (issues d'aortes) mais je n'arrive pas à en obtenir même en suivant le mode opératoire du labo (découpe de l'aorte en petit morceaux, digestion 45min à la Collagénase I, centrifugation et mise en culture dans DMEM 20%) quelqu'un aurait une méthode?
J'ai besoin des retour de personnes qui font de la culture primaire de cellules de souris, je n'ai jamais rencontré ce type de problème avec des cultures primaires de fibroblastes humains (bien plus facile à cultiver ! ! ! )
Merci d'avance,
Je recherche des conseils pour la culture primaire de fibroblastes de souris. Je suis en doctorat de biologie, mon objectif est de réaliser une expansion cellulaire de fibroblastes gingivaux de souris. Je souhaite obtenir un maximum de cellules en un minimum de passage.
Voici mon mode opératoire actuel :
- J0 : Prélèvement de gencive de souris (je prélève le maximum de tissu au niveau de la cavité bucale, y compris le palais), découpe des tissus en petits fragments que je laisse adhérer au fond d'une flasque une heure avant d'ajouter délicatement du DMEM 20% FCS + 1% peni/strep et 1% fungizone
- Le milieu est changé deux fois par semaine
- J+14 : Premier passage des Fibroblastes (lavage PBS, trypsine, neutralisation, centrifugation, comptage/viabilité), je les repique à 10^6 pour une flasque de 150 cm2 dans du DMEM 10% + 1% peni/strepto et 0,5% fungizone.
- Le milieu est changé deux fois par semaine
- J+28 : 2e passage est j'utilise mes cellules pour une thérapie cellulaire sur souris.
Voici mon problème, je garde toujours un peu de cellules pour les remettre en culture mais à partir de là, elles changent de morphologie et sont plus grosses, pas mal d'entre elles meurent et beaucoup de débris sont présent dans le surnageant de culture. Je suppose que ce sont les signes de sénescence de la culture primaire.
J'ai déjà essayé de faire un 2e passage à J+21 et faire ma thérapie au passage 3 mais les cellules montrent "précocement" les signes de sénescence entre P2 et P3, c'est la raison pour laquelle je laisse mes cellules en culture deux semaines jusqu'à une très forte confluence. Je sais que garder des cellules à confluence n'est pas très conseillé mais c'est la seule alternative que j'ai trouvé.
Y aurait il quelqu'un qui aurait des conseil à me donner sur la culture primaire de souris?
J'essai aussi de mettre en culture des cellules musculaires lisses de souris (issues d'aortes) mais je n'arrive pas à en obtenir même en suivant le mode opératoire du labo (découpe de l'aorte en petit morceaux, digestion 45min à la Collagénase I, centrifugation et mise en culture dans DMEM 20%) quelqu'un aurait une méthode?
J'ai besoin des retour de personnes qui font de la culture primaire de cellules de souris, je n'ai jamais rencontré ce type de problème avec des cultures primaires de fibroblastes humains (bien plus facile à cultiver ! ! ! )
Merci d'avance,
via Forum FS Generation http://ift.tt/1j8dZz2
Aucun commentaire:
Enregistrer un commentaire